高精度、低脫靶，近期，國(guó)內(nèi)科學(xué)家的一項(xiàng)研究為基礎(chǔ)研究帶來(lái)新的堿基編輯工具。
Nature Chemical Biology 刊登研究成果。本文圖片來(lái)源均為：華東師范大學(xué)
10月19日，澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者從華東師范大學(xué)獲悉，近日，華東師范大學(xué)李大力教授團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)并命名了一種精準(zhǔn)且安全的新型腺嘌呤堿基編輯器——ABE9，能夠有效解決臨床應(yīng)用存在的各類(lèi)脫靶隱患和安全性問(wèn)題，理論上將為近50%遺傳致病性單核苷酸變異（SNVs）的糾正提供新的精準(zhǔn)靶向工具。
該項(xiàng)研究成果于10月13日以Engineering precise adenine base editor with minimal bystander editing 為題在 Nature Chemical Biology 雜志上發(fā)表。
DNA堿基編輯器在種質(zhì)改良和基因治療中被寄予厚望
DNA堿基編輯器是一種創(chuàng)新的基因組編輯工具，它可以在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）、不需要供體DNA模板的情況下高效地催化堿基轉(zhuǎn)換，因此在種質(zhì)改良和基因治療中被寄予厚望。
堿基編輯技術(shù)最早由哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)，他們通過(guò)將Cas9酶活突變型蛋白（nickase Cas9）分別與胞嘧啶脫氨酶或者腺嘌呤脫氨酶融合開(kāi)發(fā)出初代的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor, ABE），不過(guò)，由于堿基切除修復(fù)通路的激活，CBE除了誘導(dǎo)C到T的堿基轉(zhuǎn)化，也會(huì)一定程度上產(chǎn)生非T的副產(chǎn)物和Indels（插入和缺失事件）。最近，包括中科院遺傳發(fā)育所高彩霞、中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝等在內(nèi)的多個(gè)權(quán)威課題組，陸續(xù)報(bào)道了CBE處理的細(xì)胞和胚胎中存在嚴(yán)重的隨機(jī)脫靶現(xiàn)象。
與CBE不同的是，第一代的ABEs（如ABE7.10, ABEmax） 幾乎只產(chǎn)生純的A到G的轉(zhuǎn)換（≥99.9%），而不誘導(dǎo)顯著的Indels（通常≤0.1%）。更重要的是，ABE7.10極少誘導(dǎo)非Cas9依賴(lài)的脫靶編輯。
這些優(yōu)秀的特性使得ABEs在未來(lái)的臨床應(yīng)用中有許多優(yōu)勢(shì)。
然而，ABE7.10的編輯效率對(duì)于很多靶點(diǎn)而言不盡如人意，David Liu等課題組通過(guò)分子進(jìn)化獲得了更高活性的ABE8（ABE8e和ABE8s），但是ABE8并沒(méi)有解決ABE原有的缺陷。例如，ABE會(huì)引起大量隨機(jī)的RNA脫靶編輯。
此外，由于A(yíng)BE8編輯窗口變寬，還會(huì)引起非目標(biāo)堿基改變而產(chǎn)生旁觀(guān)者效應(yīng)以及ABE會(huì)在特定的TCN motif的背景序列中誘導(dǎo)胞嘧啶堿基的轉(zhuǎn)換。
新型編輯器：有望極大提高將來(lái)臨床應(yīng)用的安全性
10月13日，華東師范大學(xué)李大力與宋高潔以及廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥課題組發(fā)現(xiàn)“精準(zhǔn)安全”的腺嘌呤堿基編輯器ABE9，將編輯窗口縮窄至1-2nt，幾乎完全消除了對(duì)胞嘧啶的脫靶編輯，更重要的是將DNA/RNA脫靶事件降低到背景水平，有效解決了傳統(tǒng)ABE潛在的各類(lèi)脫靶隱患，理論上將為近50%遺傳致病性SNVs的糾正提供了新的精準(zhǔn)靶向工具。
該研究首先證明了高活性的ABE8e引發(fā)了更嚴(yán)重的旁觀(guān)者效應(yīng)以及Cas9非依賴(lài)的DNA和RNA脫靶，而且對(duì)于胞嘧啶的編輯效率顯著提高。為了解決ABE8e的精準(zhǔn)性問(wèn)題，該研究基于A(yíng)BE8e的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和篩選，發(fā)現(xiàn)在TadA-8e脫氨酶的活性口袋引入關(guān)鍵突變L145T和N108Q（ABE9）可在保留高編輯活性的同時(shí)，顯著縮小編輯窗口到sgRNA的第5-6位，消除對(duì)胞嘧啶的編輯活性。
TadA-8e蛋白結(jié)構(gòu)及ABE9編輯特性評(píng)價(jià)。
通過(guò)鑒定Cas9非依賴(lài)性脫靶的R-Loop檢測(cè)以及RNA脫靶的轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ABE9幾乎不引起隨機(jī)的DNA和RNA脫靶編輯，展示出了極高的應(yīng)用安全性。
Cas9非依賴(lài)DNA脫靶和RNA脫靶評(píng)價(jià)。
此外，ABE9在小鼠和大鼠胚胎中都展示出極高的體內(nèi)編輯精度和活性。在所有的F0代小鼠中，ABE9可以高效精準(zhǔn)編輯A5（14/16只），其中25%小鼠的編輯效率超過(guò)80%，所有F0小鼠的平均效率達(dá)到54.3%，而傳統(tǒng)ABE8e在編輯A5目標(biāo)位點(diǎn)的同時(shí)引起了大量的A8位的旁觀(guān)者編輯（18/19只），精確編輯A5位比例僅占5.1%。更進(jìn)一步，ABE9在大鼠中能夠靶向Gaa基因精準(zhǔn)產(chǎn)生D645G突變而誘發(fā)龐貝氏病，F(xiàn)0代大鼠中僅含目的位點(diǎn)A6-to-G突變的達(dá)到48.41%，而早期版本ABE7.10的精準(zhǔn)編輯只占2.76%。嚙齒類(lèi)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)再次證明了ABE9高精度特性，也凸顯了其在精準(zhǔn)構(gòu)建動(dòng)物模型的潛力。
ABE9在動(dòng)物體內(nèi)編輯及糾正人類(lèi)致病性的SNVs。
為進(jìn)一步評(píng)估ABE9基因治療的潛能和其精準(zhǔn)的特性，研究者構(gòu)建了4個(gè)含有人類(lèi)致病SNVs的細(xì)胞系。這些位點(diǎn)中需要糾正的腺苷處于sgRNA第五位且處于多個(gè)連續(xù)腺苷中。
結(jié)果表明，ABE9能精準(zhǔn)編輯sgRNA第五位的腺嘌呤并產(chǎn)生所需的A-to-G轉(zhuǎn)換，其精確糾正能力相較于A(yíng)BE8e最大提高了342.5倍。
最后，為了無(wú)偏見(jiàn)地分析ABE9的精準(zhǔn)編輯特性，該研究采用含有8954條sgRNA與靶點(diǎn)配對(duì)的文庫(kù)在細(xì)胞中進(jìn)行編輯窗口的分析，發(fā)現(xiàn)ABE9非常精準(zhǔn)且無(wú)序列偏好地主要編輯A5-A6兩位堿基，證明其廣泛地精準(zhǔn)編輯特性。
靶向文庫(kù)分析無(wú)偏見(jiàn)的評(píng)價(jià)ABE9編輯特性。
總的來(lái)說(shuō)，ABE9實(shí)現(xiàn)了高精度、低脫靶的堿基編輯，這不僅為基礎(chǔ)研究帶來(lái)新的堿基編輯工具，更為重要的是有望極大提高將來(lái)臨床應(yīng)用的安全性。ABE9將來(lái)還可以與識(shí)別不同PAM的Cas變體融合，進(jìn)一步擴(kuò)大靶向范圍。
另?yè)?jù)上海邦耀生物科技有限公司消息，ABE9已提前完成核心專(zhuān)利申請(qǐng)，未來(lái)專(zhuān)利布局將覆蓋全球主流市場(chǎng)。
李大力(左數(shù)第9位）教授團(tuán)隊(duì)參加中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)基因組編輯分會(huì)第三次代表大會(huì)。
華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生陳亮，碩士研究生張舜、薛念念，博士研究生洪夢(mèng)佳以及副研究員張曉輝為該論文的共同第一作者，華東師范大學(xué)為第一單位，華東師范大學(xué)李大力教授、宋高潔教授和廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥教授為本文通訊作者。
華東師范大學(xué)劉明耀教授，北京大學(xué)伊成器教授課題組對(duì)本項(xiàng)研究提供了重要支持。該研究受到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金以及上海市教委前沿科學(xué)基地和重大項(xiàng)目等支持。
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記者丨鄒佳雯
來(lái)源丨澎湃新聞
編輯丨王越月
編審丨戴琪
